Virale RNAi Suppressoren

HC-Pro as a tool to study silencing suppressor-mediated induction of disease symptoms in plants

RNAi ist ein komplexer Mechanismus (Abb. 1), der in Pflanzen einerseits bei der endogenen Genregulation eine wichtige Rolle übernimmt, hauptsächlich aber zur Kontrolle der Expression fremder Nukleinsäuren dient. Neben der Inaktivierung genomintegrierter Elemente wie den Transposons und Retroviren, fungiert die RNAi als Abwehrmechanismus gegen Viren (Abb. 1, hellblaue Box). Im Laufe der Evolution haben allerdings eine Vielzahl von Pflanzen-Viren Proteine, sog. "silencing suppressor" Proteine, entwickelt, die diesen Mechanismus blockieren können. Die meisten dieser Proteine binden 21 bis 24 Nukleotid lange dsRNA Moleküle, die bei der RNAi eine Schlüsselrolle spielen (Abb. 1). Da endogene kurze dsRNAs (miRNAs und tasiRNAs) für die normale Entwicklung der Pflanzen essenziell sind, hat der Verlust der freien Verfügbarkeit solcher RNA-Moleküle dramatische Folgen. Vor allem Pflanzen, deren miRNA-vermittelte Genregulation gestört ist, zeigen starke phänotypische Veränderungen, die den Symptomen, die in der Regel bei Virusinfektionen auftreten, sehr ähnlich sind. Im Rahmen eines DFG-Projekts (siehe Förderung) haben wir eines dieser dsRNA-bindenden "silencing suppressor" Proteine erforscht. Mit Hilfe von mutagenisierten Varianten dieses Proteins haben wir die Bindungseigenschaften von dsRNAs untersucht. Es konnten Varianten des Proteins isoliert werden, die bei Expression in der Pflanze ihre Funktion als "silencing suppressor" beibehalten haben, aber keine auffälligen Entwicklungsstörungen mehr hervorrufen. Es liegt nahe, dass die veränderten Proteine nach wie vor die Funktionalität der siRNAs aufheben, aber nicht die der miRNAs. Weitere Details über das DFG-Projekt und die Studien, die unsere Arbeitsgruppe zu diesem Projekt beiträgt, können in den von uns publizierten Artikeln abgerufen werden (siehe Veröffentlichungen: Jamous et al., J. Gen. Virol., 2011 und Füllgrabe et al., Protein Expr. Purif., 2011).


Abbildung 1: Vereinfachtes Modell der RNAi, das die Überexpression von Transgenen unterbindet und zur Abwehr von Pflanzen-Viren dient.

 

Begomovirus-satellite encoded suppressors as a tool to study microRNA-mediated induction of disease symptoms in plants

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine endogene RNAs, die bei der Regulation pflanzlicher und tierischer Gene mitwirken. MiRNAs steuern eine Vielzahl von Aufgaben, so zum Beispiel die Entwicklung der Pflanze, die Signaltransduktion, den Proteinabbau und die Antwort auf umwelt- bzw. pathogeninduzierte Stressfaktoren. Einige Studien weisen darauf hin, dass miRNA-dirigierte Prozesse im direkten Zusammenhang mit der von Viren ausgelösten Pathogenität stehen. Wir haben die V2 und βC1 Genprodukte als Symptomdeterminanten und als starke RNA ?silencing suppressors? (RSSs) identifiziert. Darüber hinaus konnten auch den C2 und C4 Proteinen, die vom Cotton leaf curl Multan virus (CLCuMV, Genus Begomovirus aus der Familie der Geminiviridae) bzw. dessen Betasatelliten-RNA kodiert werden, RSS-Funktionen zugeordnet werden. In dem hier beschriebenen Projekt sollen CLCuMV- (einschließlich Betasatelliten RNA) infizierte Nicotiana benthamiana Pflanzen genutzt werden, um den Einfluss von zehn miRNAs zu untersuchen, deren Bedeutsamkeit für die Pflanzenentwicklung bekannt ist. Zusätzlich soll der Effekt auf die Akkumulation von miRNAs in Pflanzen studiert werden, in denen die vier RSS Proteine mit Hilfe eines Potato virus X (PVX) Vektors exprimiert werden. Weiterhin sollen transgene N. benthamiana Linien generiert werden, in denen die Expression der RSS Gene unter der Kontrolle des Cauliflower mosaic virus (CaMV) Promotors steht. Diese Pflanzen werden mit N. benthamiana Linien gekreuzt, die ein ?green fluorescent protein? (GFP) Transgen exprimieren. In Nachkommen dieser Kreuzungen, in denen sowohl das GFP als auch je ein RSS Transgenkonstrukt nachgewiesen werden kann, wird GFP ?silencing? initiiert, um sowohl lokales als auch systemisches ?silencing? studieren zu können. Schließlich sollen die CLCuMV- und Betasatelliten-RNA kodierten RSS Proteine in Escherichia coli produziert und für Bindungsstudien von kleinen RNAs eingesetzt werden.

 


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