CRISPR/Cas9

Das „clustered regularly interspaced short palindromic repeat“ (CRISPR) -assoziierte Protein-9 (Cas9) -Genom-Editier-System (CRISPR / Cas9) wurde von einem prokaryotischen adaptiven Immunsystem des Typs II adaptiert. Diese bahnbrechende Technologie wurde in Pflanzen häufig zur Einführung von Genommodifikationen eingesetzt und ebnete den Weg für eine Verbesserung der Eigenschaften von Nutzpflanzen. In den meisten Fällen wurden CRISPR / Cas9-DNA-Konstrukte verwendet, die durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelten T-DNA-Transfer oder biolistischen Partikelbeschuss in Pflanzen transportiert wurden. Während dieses Prozesses besteht jedoch eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass CRISPR / Cas9-Konstrukte in das Genom integriert werden. Daher wurden DNA-freie Verfahren zur Genombearbeitung entwickelt, bei denen Protoplasten-Transfektion mit Cas9 / sgRNA-Ribonukleoprotein-Komplexen eingesetzt werden. Der Protoplastenansatz setzt jedoch eine ausgedehnte Gewebekultur für die Regeneration von Pflanzen voraus, die die gewünschten Mutationen tragen, was mit dem Risiko behaftet ist, dass unerwünschte somaklonale Variationen auftreten. Wir planen die Entwicklung einer Genom-Editier-Methode, die nicht nur DNA-frei sondern vielmehr auch gewebekulturfrei ist.

Wir haben bereits ein Hochdrucksprühverfahren entwickelt, mit dem RNA-Moleküle effizient in Pflanzenblätter und meristematisches Gewebe appliziert werden können (Dalakouras et al., 2016). Mit dieser Technik wollen wir nun Cas9 / sgRNAs entweder als DNA-freien Ribonukleoprotein (RNP) -Komplexe oder als reine Mischung aus RNA-Molekülen in das Spross-Apikalische-Meristem (SAM) einer grün fluoreszierenden Protein (GFP) -exprimierenden Tomate einführen. Lipid-Doppelhydroxid-Nanoschichten (LDH-Nanopartikel) sollen eingesetzt werden, um die Cas9 / sgRNA-Komplexe zu stabilisieren und deren Einführung in die Pflanzenzellen zu erleichtern. Durch die eingebrachten CRISPR-Systeme sollte die Editierung des Genoms (hier des GFP-Transgens) in SAM-Zellen stattfinden. Die neu entstandenen Blätter und Zweige sollten dann die gewünschten Mutationen tragen, die durch die Hemmung der GFP-Expression unter UV-Licht sichtbar gemacht werden können. Schließlich wird erwartet, dass sich nach Selbstbestäubung von Blüten der mutierten Zweige mutierte Samen entwickeln. Somit werden in der nächsten Generation einige der Pflanzen die gewünschte Mutation stabil tragen. Die hier vorgeschlagene Methode zum Genom-Editieren könnte großen Einfluss auf Entwicklungen in der Pflanzenbiotechnologie sowie der Pflanzenzüchtung haben. Man kann sich vorstellen, dass der erfolgreiche Ausgang dieses Vorschlags den Weg für eine DNA-freie und gewebekulturfreie Genom-Editierung für schwierig zu regenerierende Nutzpflanzen und wahrscheinlich auch für holzige Pflanzen mit langen Fortpflanzungszyklen ebnen wird.

Laufende Projekte

DNA- und gewebekulturfreie Genom-Editierung (FreeEdit)

Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), "Crop plants of the future", Projekt-Nr.: 031B0531, Projekt-Laufzeit: 06/2018-05/2020

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